A la fin de ses études secondaires, Justin Chambers s'envole pour la France où un agent le remarque dans le métro et lui recommande de tenter le mannequinat. Justin Chambers suit ses conseils et entame une très fructueuse carrière de top model, posant par exemple pour Calvin Klein. Dans les années 1990, il délaisse un peu l'objectif des photographes pour apparaître une première fois devant les caméras sur le tournage de la série télé 'Another World'. Il y interprète Nick. Suit ensuite 'Swift Justice' où il se glisse dans la peau d'un délinquant juvénile. En 1996, il obtient le rôle vedette dans la série 'Unis'. En 1999, Justin Chambers se confronte au monde du cinéma. Il fait ses débuts aux côtés d'Adrien Brody dans 'Liberty Heights'. Puis il partage l'affiche avec Jennifer Lopez et Matthew McConaughey dans 'Un mariage trop parfait' en 2001. Autre expérience la même année, aux côtés de Catherine Deneuve dans 'D' Artagnan'. Mais c'est à la télé que le jeune acteur va se faire remarquer par le public, en particulier le public féminin, avec son rôle dans la série à succès Grey's Anatomy.

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